765.隐蔽、狡猾、善变（2/2）

为了确定局部照射对肿瘤生长和mdscs的影响，当肿瘤直径达到时，我们使用大分割rt(20gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是cd11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致mdscs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总mdscs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润mdscs的比例比未治疗肿瘤高2倍(=±%±%，)。pmn-mdscs与总mdscs具有相同的增加趋势(=±%±%，)，而m-mdsc比例保持在约%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

为了确定受照射肿瘤中pmn-mdsc的逐渐积累是否有助于llc肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗ly-6g单克隆抗体来消耗抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pmn-mdsc的频率（）。此外，用抗ly-6g抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明pmn-mdsc的募集对肿瘤再生至关重要。

虽然pmn-mdscs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对cd8+t细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定rt后pmn-mdscs诱导的免疫抑制是否依赖于cd8+t细胞，我们通过流式细胞术评估了cd8+t细胞的数量和功能。

如图3d所示，cd8+t细胞的百分比随着照射从±%下降到±%()。pmn-mdsc耗竭逆转了这种下降（rt+anti-ly-6g抗体=±%±%，）。为了更好地了解cd8+t细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了cd8+t细胞内部和表面上ifn-γ、cd28和pd-1的表达。局部rt显着降低了cd8+t细胞分泌ifn-γ的比例，从%降至%，并增加了表达pd-1的cd8+t细胞的比例（=±±）au，）。

cd28表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的llc小鼠相同的水平（±%），而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议pmn-mdscs通过抑制cd8+t细胞促进放疗后肿瘤的再生。pmn-mdscs不仅抑制了tme中cd8+t细胞的数量，而且还抑制了其活性。

为了确定辐照诱导mdscs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及inos和arg1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部rt增强了arg1的表达，但没有增强inos的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从/l提高到/l(()。相比之下，no荧光标记的inos活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

pd-l1的表达是mdscs的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1上调是否是rt后mdscs介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后mdsc中pd-l1的表达。图4e显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的mdsc中的pd-l1表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：=±±，）.然而，此后pd-l1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（=1，±±，）。外周血中mdscs的pd-l1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

以上数据表明arg1表达的上调是照射后pmn-mdscs抑制功能的合理机制。然而，不涉及pd-l1和inos的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1抑制剂nor-noha。10mg/kg/dnor-noha有效地将arg1活性从/l降低到/l（）。

rt后给予nor-noha显着增加cd8+t细胞比例（+nor-noha=%，），并伴有肿瘤再生延迟。inos抑制剂1400w对肿瘤再生长没有影响。

我们的结果表明，rt通过上调肿瘤内pmn-mdsc的百分比和arg1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pmn-mdscs及其arg1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5抑制剂可以抑制tb小鼠和癌症患者mdsc中inos和arg1的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20mg/kg/d，以研究它是否可以促进rt的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nor-noha相当。tme的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内pmn-mdsc的比例从±%下降到±%。

此外，西地那非也显着降低了arg1的表达。为了进一步检查西地那非对mdsc的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内cd8+t细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明cd8+t细胞的百分比从±%增加到±%。

此外，当给予西地那非时，cd8+t细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5抑制剂西地那非通过调节pmn-mdscs改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

工作揭示了pmn-mdscs中arg1通路介导rt后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，pmn-mdscs是辐照招募的主要亚型，而不是m-mdscs。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是pmn-mdscs在放疗后抑制cd8+t细胞的主要机制。为了克服pmn-mdscs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和rt联合使用降低了pmn-mdscs在tme内的募集和免疫抑制作用，激活了cd8+t细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制tme以提高rt治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，mdscs及其亚型如何影响tme仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。

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