741.三年后的问候（2/3）

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为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了T细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4Gy-RT显示在肿瘤胰岛浸润的CD8+T细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在HKP1肺中干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/CD4+T细胞和GzmB+/CD8+T细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4Gy-RT诱导的T细胞活性与其抑制PD-1的协同作用是一致的。越来越多的T细胞被招募到HKP1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为CD4+T细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(扩展数据图2a，b)。为了确定4Gy-RT是否增强了原有T细胞的功能，我们用S1P受体抑制剂FTY720治疗HKP1小鼠，FTY720可以阻止活化的T细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，FTY720治疗通过减少循环T细胞(扩展数据图2d)，将4Gy-RT的效果局限于肺部原有的T细胞。与对照组相比，FTY720取消了4Gy-RT增加干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/CD4+T细胞和GzmB+/CD8+T细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在FTY720处理的小鼠中，4Gy-RT和抗PD-1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4Gy-RT并不能重新激活TME中原有的功能紊乱的T细胞。

4Gy-RT治疗可激活TME中的肺驻留棒状细胞

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为了探索4Gy-RT诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了RT诱导的树突状细胞(DC)的激活。4Gy-RT治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中CD103+交叉呈递的DC(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受RT(0Gy、4Gy或8Gy×3)联合IgG或PD-1抗体治疗的HKP1肺进行RNA-SEQ分析。比较4Gy-RT组、0Gy(模拟)组和8Gy-RT(无效剂量)组在抗PD-1治疗前后的差异表达基因(P<，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将IgG队列中4Gy-RT上调的基因与抗PD-1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个Gy-RT特征基因的细胞来源，我们对接受0Gy或4Gy-RT的HKP1荷瘤肺进行了单细胞RNA-seq(scRNA-seq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(t-SNE)图，我们发现这些基因在4Gy-RT后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。

棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关

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无论采用哪种耗竭方法，携带HKP1的肺对4Gy-RT的免疫反应均明显减弱，表现为T细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(CD4+T细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-α和CD8+T细胞中的GzmB)(图4C和扩展数据图6d)。值得注意的是，在HKP1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。

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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4Gy-RT治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高ICIs疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用Scgb1a1-CreERTM/Snap23Flox/Flox转基因小鼠(简称Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺TME。突触体相关蛋白23(SNAP23)是SNARE复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失Snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析证实，与野生型对照相比，4Gy-RT治疗的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分CC10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺对4Gy-RT反应中T细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。

棒状细胞减少促肿瘤炎症